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荧光定量PCR简介

浏览次数: 日期:2019年4月10日 07:41

摘要:

  荧(ying)光(guang)(guang)定量PCR检测技(ji)术(shu)诞(dan)生至今已(yi)10多(duo)年(nian)的(de)(de)时间,而其应用一(yi)(yi)(yi)直都没广泛展开(kai),究其原(yuan)因,无外(wai)乎受制(zhi)于相关(guan)仪器、试剂(ji)和技(ji)术(shu)的(de)(de)发(fa)展。近期,尤(you)其是08年(nian)以(yi)来(lai),仪器和试剂(ji)是遍地(di)开(kai)花,这(zhei)(zhei)(zhei)也(ye)使科(ke)研(yan)(yan)人员均(jun)跃跃欲(yu)试,都想借此技(ji)术(shu)使自己(ji)的(de)(de)研(yan)(yan)究能(neng)突飞猛(meng)进,发(fa)展势头通过查(cha)找每年(nian)所(suo)发(fa)表的(de)(de)文章数(shu)可一(yi)(yi)(yi)目(mu)了然。据(ju)有关(guan)统计,在 Medline 数(shu)据(ju)库中,用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作(zuo)为(wei)关(guan)键词检索,1996 年(nian)是19 篇(pian),1999 年(nian)157 篇(pian),到2003 年(nian)就(jiu)高达2984 篇(pian),2009年(nian)会是多(duo)少呢?J9九游会AG 不得而知。但其迅猛(meng)的(de)(de)发(fa)展势头却是不可更改(gai)的(de)(de),本公(gong)司真诚希望能(neng)和众多(duo)研(yan)(yan)究人员共同努(nu)力,抓住(zhu)这(zhei)(zhei)(zhei)一(yi)(yi)(yi)大好(hao)时机,为(wei)科(ke)研(yan)(yan)事业(ye)的(de)(de)发(fa)展贡献自身的(de)(de)力量。基于这(zhei)(zhei)(zhei)一(yi)(yi)(yi)目(mu)标,本公(gong)司长期以(yi)来(lai)对荧(ying)光(guang)(guang)定量PCR,无论是技(ji)术(shu)还(hai)是多(duo)年(nian)来(lai)的(de)(de)产(chan)品,均(jun)进行(xing)了深入地(di)研(yan)(yan)究,并及时推(tui)出(chu)更加优异的(de)(de)荧(ying)光(guang)(guang)定量 PCR技(ji)术(shu)服务。

荧光定量PCR原理

  荧(ying)光(guang)(guang)定(ding)量PCR最早称TaqMan PCR,后(hou)来(lai)也(ye)叫Real-Time PCR,是(shi)美国PE(Perkin Elmer)公司(si)1995年研(yan)制出来(lai)的(de)(de)一种新的(de)(de)核(he)酸定(ding)量技(ji)术(shu)。该(gai)技(ji)术(shu)是(shi)在常规PCR基础上(shang)加(jia)入荧(ying)光(guang)(guang)标记探针或相应的(de)(de)荧(ying)光(guang)(guang)染料来(lai)实(shi)现其(qi)(qi)定(ding)量功能的(de)(de)。其(qi)(qi)原(yuan)理:随着PCR反应的(de)(de)进行,PCR反应产物不断累计,荧(ying)光(guang)(guang)信号强(qiang)(qiang)度(du)也(ye)等比例增加(jia)。每经过(guo)一个循(xun)环,收集一个荧(ying)光(guang)(guang)强(qiang)(qiang)度(du)信号,这样J9九游会AG 就(jiu)可以通过(guo)荧(ying)光(guang)(guang)强(qiang)(qiang)度(du)变化监测产物量的(de)(de)变化,从(cong)而得到一条荧(ying)光(guang)(guang)扩(kuo)增曲线图。

  一般(ban)而言,荧(ying)(ying)光(guang)(guang)扩(kuo)增(zeng)(zeng)曲(qu)线(xian)(xian)(xian)可以(yi)分成三个阶(jie)(jie)段(duan)(duan)(duan):荧(ying)(ying)光(guang)(guang)背景信号(hao)(hao)阶(jie)(jie)段(duan)(duan)(duan),荧(ying)(ying)光(guang)(guang)信号(hao)(hao)指(zhi)(zhi)数扩(kuo)增(zeng)(zeng)阶(jie)(jie)段(duan)(duan)(duan)和(he)平台期。在(zai)(zai)荧(ying)(ying)光(guang)(guang)背景信号(hao)(hao)阶(jie)(jie)段(duan)(duan)(duan),扩(kuo)增(zeng)(zeng)的(de)(de)荧(ying)(ying)光(guang)(guang)信号(hao)(hao)被荧(ying)(ying)光(guang)(guang)背景信号(hao)(hao)所掩盖,无法判断(duan)产物量(liang)的(de)(de)变化(hua)。而在(zai)(zai)平台期,扩(kuo)增(zeng)(zeng)产物已不再(zai)呈(cheng)指(zhi)(zhi)数级的(de)(de)增(zeng)(zeng)加,PCR 的(de)(de)终(zhong)产物量(liang)与(yu)(yu)起(qi)(qi)始(shi)(shi)模板量(liang)之(zhi)(zhi)间(jian)没有线(xian)(xian)(xian)性关系,根据最终(zhong)的(de)(de) PCR 产物量(liang)也不能(neng)计算出起(qi)(qi)始(shi)(shi) DNA 拷(kao)贝数。只有在(zai)(zai)荧(ying)(ying)光(guang)(guang)信号(hao)(hao)指(zhi)(zhi)数扩(kuo)增(zeng)(zeng)阶(jie)(jie)段(duan)(duan)(duan), PCR产物量(liang)的(de)(de)对数值与(yu)(yu)起(qi)(qi)始(shi)(shi)模板量(liang)之(zhi)(zhi)间(jian)存在(zai)(zai)线(xian)(xian)(xian)性关系,J9九游会AG 可以(yi)选择在(zai)(zai)这(zhei)个阶(jie)(jie)段(duan)(duan)(duan)进行定量(liang)分析。为(wei)了(le)定量(liang)和(he)比较的(de)(de)方便,在(zai)(zai)实时(shi)荧(ying)(ying)光(guang)(guang)定量(liang) PCR 技术中引入了(le)两个非常重要的(de)(de)概念:荧(ying)(ying)光(guang)(guang)阈(yu)值和(he) CT值(如下(xia)图(tu)所示)。

荧光域值(threshold)

  是在荧(ying)光扩增曲线上(shang)(shang)人为设定的(de)(de)一(yi)个(ge)值,它可以设定在荧(ying)光信号指数扩增阶段任意位置上(shang)(shang),但一(yi)般(ban)荧(ying)光域值的(de)(de)缺省(sheng)设置是PCR反应前3-15个(ge)循(xun)环荧(ying)光信号标(biao)准偏差(cha)的(de)(de)10倍,即:threshold。

 

Ct值与起始模板的关系:

  研究表(biao)明,每(mei)个模板的Ct值与该模板的起(qi)始拷贝(bei)(bei)数(shu)(shu)的对数(shu)(shu)存在(zai)线性关系,起(qi)始拷贝(bei)(bei)数(shu)(shu)越(yue)多(duo),Ct值越(yue)小(xiao)。利用已(yi)知起(qi)始拷贝(bei)(bei)数(shu)(shu)的标(biao)准品(pin)可作出(chu)标(biao)准曲线,其(qi)中(zhong)横坐标(biao)代(dai)表(biao)起(qi)始拷贝(bei)(bei)数(shu)(shu)的对数(shu)(shu),纵坐标(biao)代(dai)表(biao)Ct值如下(xia)图所示(shi)。因此,只要获得未(wei)知样(yang)品(pin)的Ct值,即(ji)可从标(biao)准曲线上计(ji)算(suan)出(chu)该样(yang)品(pin)的起(qi)始拷贝(bei)(bei)数(shu)(shu)。

 

荧光定量检测

  荧光(guang)定(ding)量检测根据(ju)所使(shi)用的(de)标记物不同(tong)可分为(wei)(wei)荧光(guang)探针(zhen)和(he)(he)荧光(guang)染(ran)料(liao)(liao)(liao)。荧光(guang)探针(zhen)又包括Beacon技(ji)术(shu)(shu)(分子信标技(ji)术(shu)(shu),以(yi)美国(guo)人(ren)Tagyi为(wei)(wei)代(dai)表(biao))、 TaqMan探针(zhen)(以(yi)美国(guo)ABI公(gong)司(si)为(wei)(wei)代(dai)表(biao))和(he)(he)FRET技(ji)术(shu)(shu)(以(yi)罗氏公(gong)司(si)为(wei)(wei)代(dai)表(biao))等;荧光(guang)染(ran)料(liao)(liao)(liao)包括饱(bao)(bao)(bao)和(he)(he)荧光(guang)染(ran)料(liao)(liao)(liao)和(he)(he)非(fei)饱(bao)(bao)(bao)和(he)(he)荧光(guang)染(ran)料(liao)(liao)(liao),非(fei)饱(bao)(bao)(bao)和(he)(he)荧光(guang)染(ran)料(liao)(liao)(liao)的(de)典型代(dai)表(biao)就是(shi)现在最常用的(de)SYBR GreenⅠ;饱(bao)(bao)(bao)和(he)(he)荧光(guang)染(ran)料(liao)(liao)(liao)有EvaGreen、LC Green等。

嵌合荧光染料法(SYBR GreenⅠ)

  SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的(de)DNA结合染(ran)料,与(yu)双(shuang)链DNA非特异性结合。在游(you)离状(zhuang)态(tai)下,SYBR Green I发出(chu)(chu)微(wei)弱的(de)荧光,但一(yi)旦与(yu)双(shuang)链DNA结合,其(qi)荧光增加(jia)1000倍。所(suo)以,一(yi)个反应发出(chu)(chu)的(de)全部荧光信号与(yu)出(chu)(chu)线的(de)双(shuang)链DNA量呈比列,且(qie)会随扩增产物的(de)增加(jia)而增加(jia)。

 

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合

  双链DNA结合染料的优点:实(shi)验(yan)设计(ji)简单,仅需要2个引物,不(bu)需要设计(ji)探(tan)针(zhen),无(wu)需设计(ji)多个探(tan)针(zhen)即可以快速检验(yan)多个基因,且能够进(jin)行熔点曲线分析,检验(yan)扩增反应(ying)的特异性,低的初始(shi)成(cheng)本,通用性好,因此国内外在科研中使(shi)用比(bi)较普遍。

  荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)探针法(Taqman 技术):PCR扩(kuo)(kuo)增(zeng)时(shi),加入(ru)一(yi)(yi)(yi)对引(yin)物的(de)(de)同(tong)时(shi)再加入(ru)一(yi)(yi)(yi)个(ge)(ge)特异性(xing)的(de)(de)荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)探针。该探针为一(yi)(yi)(yi)直线(xian)型(xing)的(de)(de)寡核(he)苷酸,两端分别标记一(yi)(yi)(yi)个(ge)(ge)荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)报告(gao)基(ji)团和(he)一(yi)(yi)(yi)个(ge)(ge)荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)淬灭(mie)基(ji)团,探针完整时(shi),报告(gao)基(ji)团发射的(de)(de)荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)信(xin)号被淬灭(mie)基(ji)团吸收,PCR 仪检测不到(dao)荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)信(xin)号; PCR扩(kuo)(kuo)增(zeng)时(shi)(在延伸阶段),Taq 酶的(de)(de) 5' - 3' 切(qie)酶活性(xing)将(jiang)探针酶切(qie)降解,使报告(gao)荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)基(ji)团和(he)淬灭(mie)荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)基(ji)团分离,从(cong)而荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)监(jian)测系统可(ke)接收到(dao)荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)信(xin)号,即每扩(kuo)(kuo)增(zeng)一(yi)(yi)(yi)条 DNA 链,就有一(yi)(yi)(yi)个(ge)(ge)荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)分子(zi)形成(cheng),实(shi)现了荧(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)信(xin)号的(de)(de)累积(ji)与 PCR 产(chan)物形成(cheng)完全(quan)同(tong)步,这也是定量(liang)的(de)(de)基(ji)础所在。其过程如(ru)下图所示

 

荧光定量PCR的应用

分子生物学研究

  1 核酸定(ding)量(liang)分(fen)析。对传(chuan)染性(xing)疾病(bing)进行定(ding)量(liang)定(ding)性(xing)分(fen)析,病(bing)原微生物(wu)或病(bing)毒含量(liang)的(de)检(jian)测 , 比如近期流行的(de)甲(jia)型(xing)H1N1流感, 转(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)动植物(wu)基(ji)(ji)因(yin)拷贝数的(de)检(jian)测,RNAi 基(ji)(ji)因(yin)失活率(lv)的(de)检(jian)测等。

  2 基(ji)因表达(da)差异分析。比(bi)较经过不同处(chu)(chu)理(li)(li)(li)样本之间特(te)定基(ji)因的表达(da)差异(如药(yao)物(wu)处(chu)(chu)理(li)(li)(li)、物(wu)理(li)(li)(li)处(chu)(chu)理(li)(li)(li)、化(hua)学处(chu)(chu)理(li)(li)(li)等) ,特(te)定基(ji)因在不同时相的表达(da)差异以(yi)及cDNA芯(xin)片(pian)或差显(xian)结果的确(que)证

  3 SNP 检(jian)测(ce)。检(jian)测(ce)单(dan)核(he)苷(gan)酸(suan)多态性(xing)(xing)对于研究个(ge)体对不(bu)同(tong)疾病的(de)易感(gan)性(xing)(xing)或者个(ge)体对特定药物的(de)不(bu)同(tong)反应有着重(zhong)要(yao)的(de)意义,因分子信(xin)标(biao)结构的(de)巧妙性(xing)(xing),一旦SNP 的(de)序列信(xin)息是已知的(de),采用这种技术进行(xing)高(gao)通量的(de) SNP 检(jian)测(ce)将会变得(de)简单(dan)而准确。

  4 甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)(hua)检测。甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)(hua)同人类的(de)(de)许多疾病有关,特别是癌症, Laird 报道了一种称作 Methylight的(de)(de)技术,在扩(kuo)增之前(qian)先(xian)处理 DNA ,使得未甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)(hua)的(de)(de)胞嘧(mi)啶(ding)变成(cheng)尿嘧(mi)啶(ding),而甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)(hua)的(de)(de)胞嘧(mi)啶(ding)不(bu)受影(ying)响,用特异性的(de)(de)引物和 Taqman探(tan)针来区分甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)(hua)和非甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)(hua)的(de)(de) DNA ,这(zhei)种方法不(bu)仅方便而且灵(ling)敏(min)度更(geng)高。

医学研究

  5 产前诊断:人(ren)们(men)对遗(yi)传(chuan)性物质改变引(yin)起的(de)遗(yi)传(chuan)性疾(ji)病还(hai)无法治(zhi)疗,到目前为止,还(hai)只能只能通过产前监测(ce),减(jian)少(shao)病婴出(chu)生,以防止各类遗(yi)传(chuan)性疾(ji)病的(de)发生,如为减(jian)少(shao)X连锁遗(yi)传(chuan)病患儿的(de)出(chu)生,从孕妇的(de)外周血中分离胎(tai)儿DNA,用实(shi)时荧光定量PCR检测(ce)其Y性别(bie)决定区基(ji)因是一(yi)种(zhong)无创伤(shang)性的(de)方法,易(yi)为孕妇所(suo)接受。

  6 病(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)体(ti)检(jian)测(ce):采用荧光定(ding)量PCR检(jian)测(ce)技术可(ke)以对淋球菌、沙眼衣原(yuan)(yuan)体(ti)、解(jie)脲支原(yuan)(yuan)体(ti)、人类(lei)乳(ru)头瘤病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)、单纯(chun)疱疹病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)、人类(lei)免疫缺陷病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)、肝炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)、流感病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)、结核分枝杆菌、EB病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)和巨细胞病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)等病(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)体(ti)进(jin)行定(ding)量测(ce)定(ding)。与传统的(de)检(jian)测(ce)方法相比具有灵敏(min)度(du)高、取样少、快速简(jian)便(bian)等优点(dian)。

  7 药物疗(liao)效考核:对乙(yi)型(xing)(xing)肝炎(yan)病毒 (HBV)、丙型(xing)(xing)肝炎(yan)病毒 (HCV) 定量(liang)分(fen)析显示(shi):病毒量(liang)与某些药物的(de)疗(liao)效关系。HCV高(gao)水(shui)平表达(da),干(gan)扰(rao)(rao)素(su)治疗(liao)作用不(bu)敏感,而HCV低滴度,干(gan)扰(rao)(rao)素(su)作用敏感;在拉米(mi)夫定治疗(liao)过程(cheng)中,HBV- DNA的(de)血清含(han)量(liang)曾有(you)下降,随后若再(zai)度上(shang)升或超出以(yi)前水(shui)平,则提示(shi)病毒发生变异。

  8 肿(zhong)(zhong)瘤基因(yin)(yin)(yin)检(jian)测(ce):尽管(guan)肿(zhong)(zhong)瘤发病(bing)的机(ji)理尚未清楚,但(dan)相关(guan)(guan)基因(yin)(yin)(yin)发生突(tu)变是(shi)致癌(ai)(ai)(ai)性(xing)(xing)转(zhuan)变的根本原因(yin)(yin)(yin)已(yi)被广(guang)泛接受。癌(ai)(ai)(ai)基因(yin)(yin)(yin)的表(biao)达(da)增加(jia)和突(tu)变,在许多(duo)肿(zhong)(zhong)瘤早期(qi)就可以出现。实(shi)时荧光定(ding)量(liang) PCR不(bu)但(dan)能(neng)有效地(di)检(jian)测(ce)到基因(yin)(yin)(yin)的突(tu)变,而且可以准确检(jian)测(ce)癌(ai)(ai)(ai)基因(yin)(yin)(yin)的表(biao)达(da)量(liang)。目前用此方法进行过端粒(li)(li)酶hTERT基因(yin)(yin)(yin)、慢(man)性(xing)(xing)粒(li)(li)细胞性(xing)(xing)白血病(bing)WT1基因(yin)(yin)(yin)、肿(zhong)(zhong)瘤 ER基因(yin)(yin)(yin)、前列腺癌(ai)(ai)(ai)PSM基因(yin)(yin)(yin)、肿(zhong)(zhong)瘤相关(guan)(guan)的病(bing)毒(du)基因(yin)(yin)(yin)等多(duo)种基因(yin)(yin)(yin)的表(biao)达(da)检(jian)测(ce)。丁香(xiang)园

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